E' il quarto figlio di una famiglia ebrea (Markus Rothkowitz figlio del farmacista Jacob e Anna Goldin) ed è l'unico a frequentare una scuola talmudica per bambini. Nel 1910 il padre Jacob emigrò negli Stati Uniti. Nel 1913 lasciò il paese natale, la Lettonia, per trasferirsi con la famiglia a Portland, in Oregon (Stati Uniti d'America).Incominciò a lavorare giovanissimo in seguito alla morte del padre. Tra il 1921 e il 1923 frequentò l'università di Yale, a New Haven, nel Connecticut. Non si interessava ancora di arte. Frequentava molto la biblioteca e le sue letture preferite erano Nietzsche, Scopenhauer, Shakespeare, Eschilo, Mozart, Dostoievskij e Kierkegaard.
Amava molto il teatro e la musica. All'università fondò un giornalino polemico dal titolo: "The Yale Saturday Evening Pest". Nel 1924 si iscrive all'Art Student's League seguendo corsi di disegno dal vero e poi nel '25 segue i corsi di natura morta di Max Weber, anch'esso di origini russo-ebraiche. Si reca spesso a visitare il Metripolitan Museum of Modern Art e, dal 1929, l'appena costituito Museum of Modern Art
Max Weber attribuiva all'artista e al suo spirito creatore un ruolo profetico e considerava l'arte più una rivelazione che una rappresentazione.
La sua prima esposizione risale al 1928 presso una collettiva alle Opportunity Galleries di New York. Negli anni seguenti allacciò una profonda amicizia con altri grandi artisti del calibro di Milton Avery e Adolph Gottlieb. Nel 1933 tornò a Portland per organizzare la sua prima personale, a cui seguì lo stesso anno un'altra personale a New York, presso la Contemporary Arts Gallery.
Nel 1935 fu uno dei fondatori del gruppo The Ten, rivolto soprattutto a ricerche nell'ambito dell'astrazione e dell'espressionismo. Tra il 1936 e il 1937 dipinse su cavalletto per il Federal Art Project e conobbe Barnett Newman. Il Federal Art Project era un progetto della WPA: La Works Progress Administration (ribattezzata nel corso del 1939, Work Projects Administration; WPA). E' stata la più grande agenzia del New Deal che diede lavoro a milioni di persone nella costruzione di opere pubbliche, come edifici, strade e nella realizzazione di grandi progetti nelle arti, teatro, media e alfabetizzazione. Sfamò bambini e distribuì alimenti, vestiti e alloggi. Quasi ogni comunità negli Stati Uniti d'America ha un parco, un ponte o una scuola costruiti dalla WPA, soprattutto negli Stati occidentali e tra le popolazioni rurali. Per questi aiuti tra il 1936 e il 1939 il governo USA spese circa 7 miliardi di dollari.
La FAP fu creato non come attività culturale, ma come misura di soccorso per impiegare artisti e artigiani per creare murales, quadri da cavalletto, sculture, arti grafiche, poster, fotografie, scenografie teatrali. Il WPA Federal Art Project ha creato più di 100 centri d'arte comunitari in tutto il paese, ha studiato e documentato il design americano, commissionato un significativo corpus di arte pubblica senza restrizioni di contenuti o argomenti e ha sostenuto circa 10.000 artisti e artigiani durante la Grande Depressione .
Rothko cominciò una stretta collaborazione con Gottlieb, sviluppando uno stile pittorico dal contenuto mitologico, figure piatte e derivate dal linguaggio artistico primitivo. Intorno al 1945 avvicinò il suo stile alle tecniche e alle immagini del surrealismo e, grazie a Peggy Guggenheim, poté allestire una personale alla galleria Art of This Century di New York.
Il suo lavoro si concentrò sulle emozioni di base, spesso riempendo grandi tele di canapa con pochi colori intensi e solo piccoli dettagli immediatamente comprensibili. Per questo può anche essere considerato precursore dei pittori color field (vedi: Helen Frankenthaler). È infatti tra la fine degli anni quaranta e l'inizio degli anni cinquanta che sviluppa il suo stile della maturità.
Luminosi rettangoli colorati sembrano stagliarsi sulla tela librandosi al di sopra della sua superficie, come in Number 10. Tuttavia Rothko rimase semisconosciuto sino al 1960, sostenendosi insegnando arte, prima presso il Brooklyn Jewish Academy Center e poi alla California School of Fine Arts di San Francisco. In seguito collaborò con William Baziotes, David Hare e Robert Motherwell alla fondazione The Subjects of the Artist a New York. In questi anni strinse a New York amicizia con William Congdon e con il pittore italiano Toti Scialoja.
Solenne, intimo e umano, Mark Rothko dilata fino all'estremo punto tollerabile lo sguardo sulla fisicità del colore che diventa corpo, sangue, tormento. "Non sono interessato ai rapporti tra forma e colore o cose simili, mi interessa solo esprimere emozioni umane fondamentali : la tragedia, l'estasi, il destino; e il fatto che molta gente crolli e pianga davanti ai miei quadri significa che comunico queste emozioni fondamentali. La gente che piange di fronte ai miei quadri vive la stessa esperienza religiosa che ho vissuto io dipingendo"
La sostanziale differenza tra l'impetuosa pittura d'azione di Pollock e De Kooning e la più meditata e analitica ricerca di artisti come Cliffort Still e appunto Mark Rothko è evidente comparando ad esempio la tela One (n.31) di Pollock e un color field di Rothko come senza titolo del '59 della National Gallery of Art di Washington. Un elemento comune a tutti i pittori dell'espressionismo astratto è l'ingrandimento delle dimensioni della tela con la conseguente accentuazione della percezione fisica e ambientale dell'opera. Una trasformazione non solo quantitativa ma anche qualitativa.
L'artista attraverso le sue luminosissime tele (vedi ad es. Untitled-Plum, orange, yellow del '47-del Museo de Arte contemporanea di Città del Mexico) crea un luogo pittorico trascendente, immateriale, in cui esistono valori percettivi e stimolazioni emotive inconsce.
Nel 1958 l'architetto Ludwig Mies van der Rohe commissionò a Rothko di dipingere una serie di murales per il ristorante Four Seasons nel Seagram Building di New York, un progetto su cui lavorò per più di un anno. Negli anni Sessanta ha corrispondenza anche in Italia col critico d'arte Eraldo Di Vita.
Una volta ultimato, Rothko non fu felice di vedere le sue pitture come sfondo ad una sala da pranzo, quindi ne consegnò nove di quelle marroni e nere alla Tate Gallery, dov'è tuttora presente un'installazione permanente progettata dallo stesso Rothko.
La capacità di Rothko di esprimere una spiritualità profonda è stao il motivo per cui i De Menil, importante famiglia texana di collezionisti decidono di affidargli la decorazione della cappella dell'Univerità di Saint Thomas a Houston, nel 1964. La cappella si trovava a metà strada tra l'Università e la Menil Collection e in seguito si chiamerà soltanto Rothko Chapel. Era una cappella ecumenica, cioè senza simboli religiosi. La cappella verrà inaugurata nel 1971, un anno dopo la morte dell'artista.
La cappella è ottagonale, come un battistero, il suo spazio, spoglio e austero, rimane difficile da dominare con lo sguardo. Le pareti ospitano 14 tele di grandi dimensioni, alle quali l'artista lavorò dal 1964 al 1967, tra cui 3 trittici e 5 pannelli murali.
Fisicamente logorato a causa del suo regime alimentare (beveva e fumava con piacere) e dopo una vita segnata dalla depressione, nel primissimo mattino del 25 febbraio 1970 si suicidò nel suo studio di New York, recidendosi le vene e l'arteria del braccio destro ed intossicandosi con due flaconi di idrato di cloralio.
Il corpo venne rinvenuto dall'assistente Oliver Steindecker alle nove del mattino, che lo trovò in una pozza di sangue di fronte al lavandino e con accanto una lama da rasoio a doppio taglio; vennero poi subito contattati lo psichiatra dell'artista ed il suo cardiologo, il quale, dopo aver esaminato il cadavere, ritenne che fosse deceduto da almeno sei-otto ore. Due giorni dopo si tennero i funerali. L'anno successivo venne inaugurata a Houston la Rothko Chapel nella chiesa in cui aveva esposto l'installazione a tema ambientale nel 1967. A seguito della sua morte la determinazione della sua eredità divenne il soggetto di un famoso caso giudiziario.
Nel 2003, in occasione del centesimo anniversario della nascita, la famiglia dell'artista decise di concedere in sua memoria un contributo finanziario per il restauro della sinagoga Kaddish di Daugavpils, sua città natale in Lettonia. I lavori iniziarono nel 2003 e durarono tre anni, riportando l'edificio alla sua forma originaria. La cerimonia di riapertura, l'11 aprile 2006, avvenne alla presenza del Presidente della Lettonia Vaira Vike-Freiberga, delle autorità civili e religiose della città e della figlia dell'artista, Kate Rothko.
La fortuna di critica e di pubblico di Rothko è cresciuta senza sosta sino a farlo divenire negli anni 2000 uno degli artisti più costosi al mondo. Un suo quadro, White Center (Yellow, Pink and Lavender on Rose) è stato venduto nel maggio 2007 da Sotheby's di New York per la cifra record di 72,84 milioni di dollari, andando più che a triplicare il precedente record dell'artista, stabilito nel novembre 2005 da Christie's di New York con Homage to Matisse venduto per 22,41 milioni di dollari. Nel 2014 No. 6 (Violet, Green and Red) superò tutti i record venendo acquistata dal magnate russo Dmitrij Rybolovlev per 186 milioni di dollari, la terza cifra più alta mai pagata per un dipinto finora.